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Notas

PI3K | Biomarcadores. Oncología. PI3K, Biomarcador disponible.

Biomarcadores. Oncología. PI3K, Biomarcador disponible.

 

La ruta PI3K-AKT, es activada en una variedad de tumores, resultando en crecimiento y proliferación celular.

Mutaciones somáticas en PI3K (Fosfatidil Inositol 3kinasa), han sido reportadas en una variedad de tumores humanos, incluyendo cáncer de mama y cáncer colorrectal entre otros.

Este kit permite la detección, mediante un ensayo de Real Time PCR de 4 mutaciones somáticas: H1047R, E542K, E545K y E545D en exón 9 y 20 del gen PIK3CA.

La detección de estas cuatro mutaciones es posible en un background de DNA genómico wild type mediante  un ensayo de  real time PCR, basado en la combinación de dos tecnologías ARMS (Amplification Refrectory Mutation System) y Scorpions.

Este método es altamente selectivo, produce suficientes copias de DNA, detecta 1 % de mutante en un background de DNA wild type.


La presencia de estas mutaciones puede influir en las terapias dirigidas y el pronóstico.


La detección de estas mutaciones empleando este kit de investigación ayudará a los investigadores a determinar estas correlaciones.

 
Flujo de Trabajo
       
Step 1 Step 2 Step 3 Step 4

Tumour biopsy and sample preparation

 

Extract
DNA

 

ARMS: Selectively
amplifies target

 

Scorpions: Fluorescence indicates presence of mutation
 

A partir de una muestra de biopsia del tumor, posteriormente  a la extracción del ácido nucleico se lleva a cabo una amplificación con tecnología ARMS, la cual discrimina entre el DNA wild type y el mutado, amplificando selectivamente la secuencia target. Esto es posible ya  que los primers ARMS están diseñados complementariamente al DNA conteniendo la mutación.

De esta forma, al terminar la reacción de PCR, las únicas secuencias que se han amplificado han sido las secuencias mutadas, aun en muestras donde la mayoría de las secuencias no contienen la mutación.
 

ARMS Amplification Refractory Mutation System Reaction

ARMS primers are designed to anneal with DNA containing the mutation and alow Taq DNA polymerase to initiate a PCR reaction

ARMS primers do not amplify wild type DNA

La detección de estas secuencias amplificadas se lleva a cabo usando Scorpions. Las moléculas Scorpions son moléculas bi funcionales que contienen un primer de PCR unido covalentemente a una sonda. El fluoróforo en la sonda, interactúa con un quencher, también incorporado en la sonda, que reduce la fluorescencia por cercanía física, cuando se encuentra en su conformación más estable.

Durante la PCR, cuando la sonda se une al amplicon, el fluoróforo y el quencher se separan y esto lleva al incremento en la fluorescencia en el tubo de reacción.

 

Scorpions Reaction

  Step 1
The Scorpion primer binds to a sequence upstream of the probe target region
     
  Step 2
. The Scorpion primer is extended by DNA polymerase and the target region is copied
. The newly copied region is complementary to the probe at the 5´end of the Scorpion
. The blocking molecule stops DNA polymerase from copying the probe region

   
  Step 3
The temperature increase within the real-time PCR instrument and the newly extended Scorpions primer denatures
   
  Step 4
.
The PCR reaction cools and the extended Scorpion undergoes an internal rearrangement to hybridise itself
. The fluorohore is no longer in close proximity to its quencher and it begins to fluoresce
. Any un-extended Scorpions re-anneal and are quenched
 

En síntesis, acoplando la tecnología ARMS y las sondas Scorpions se obtiene una técnica especifica y de alta sensibilidad para detectar las mutaciones de los oncogenes en un background de DNA genómico, con resultados totalmente confiables.

 
Bioq. Mónica Rodríguez
Coordinadora División Patología y Anticuerpos
 

Bibliografía
-Scorpionsâ is a registered trademark owned by DxS Limited
-ARMSâ is a registered trademark owned by AstraZeneca Limited
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